HILIC (親水性作用液相層析) — 突破高極性分析物的滯留難題,癌症研究及生物製藥研究的必知技術

3 月【默克新星探險報】

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高極性滯留物代表:蛋白質表徵複雜轉譯後修飾-醣基化

醣基化(glycosylation)的轉譯後修飾反應(Post-translational modification, PTM)中,生物體將聚醣物殘基接到蛋白質上,產生的醣蛋白具有多種功能,包括作為細胞膜的結構成分和介導細胞相互作用等,近年來,無論是在生物製藥領域當中,作為創新藥物設計的指標;或利用人體中生物標記物醣基化的程度,作為癌症生物標記研究 (Cancer biomarker research) 的主要指標,都是相當熱門的應用。

醣基化是造成蛋白質化學多樣性的原因,尤其是單株抗體 (mAb)。醣類-蛋白質相互作用的研究也是不同藥物化學方法開發的指標。常見的醣基化分成N-linked及O-linked,分別發生在含氮和含氧胺基酸殘基上,在生物製藥領域上,也被研究者認為是 mAb 和其他治療性蛋白質研究中,所必須觀察的關鍵屬性。

無論是N-linked或是O-linked聚醣,都具有豐富且迥異的結構、高極性,這兩大特徵下,都限制了科學家在傳統層析技術RPLC上的使用。也因此,Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) 層析技術,提供與RPLC的正交選擇性,以突破滯留這道難題。

HILIC 的原理

HILIC是一種適用於分離強極性和極親水性化合物的層析技術。在 HILIC 模式下,有機溶劑構成弱移動相(Mobile phase),而水是強洗脫溶劑。由此產生的移動相富含有機物,比 RPLC 移動相更易揮發,使得 HILIC 在 LC-ESI-MS 方面具有優勢。 ESI-MS 離子源中更高效的噴霧和去溶劑化可生成更高的分析物峰並降低基線而有更靈敏的分析結果。

此外,採用螢光標記物 (ex. Procainamide) 衍生化聚醣後分離和定量也是常見策略。常用Procainamide (貨號: PHR1252) 取代兩種最常用的螢光標記 2-aminobenzamide (2-AB) 與 2-aminobenzoic acid (2-AA),無論在標記、螢光偵測效率與質譜游離效率,都相對提升,同時也可進行定量。

默克專利—BIOshell™ Glycan HPLC 層析管柱

在 HILIC技術下,默克提供BIOshell™ Glycan HPLC 層析管柱,正是專門為採用 HILIC方法進行快速、高解析度、高重現的聚醣分離實驗所設計的。使用 Fused-Core® BIOshell Glycan HPLC 管柱進行聚醣分析,有許多優勢:

  • 比同樣尺寸的傳統全多孔顆粒效率高 40%
  • 高溫穩定性(Max 65。C)、改善峰型
  • 能在高流速下運行,耐壓到14500psi
  • 管柱堵塞減少
  • 兼用 UHPLC 以及 HPLC 系統

典型聚醣分析工作流程

包括 Glycan release、標記(Labelling)、樣品cleanup、LC-MS或是螢光分析:

典型聚醣分析工作流程

此篇應用筆記開發了一個基於 UHPLC-FLR-MS 的完整工作流程來分析 N-linked glycan,包括:樣品製備和分析的步驟、Procainamide標記、使用 BIOshell™ Glycan HPLC 管柱進行分離,低流速減少溶劑消耗與質譜的兼容性。若您正在進行此一工作流程的研究,可參考下表尋找適合的耗材。

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