Merck 線上研討會 - 改善 Peptide mapping 分析工作流程: 運用技巧降低偽陰或偽陽性

主講人介紹

Yvonne Hsu 許勻菲博士

台灣默克 生命科學事業體
  • Product manager 產品經理

專精領域:

  • Chromatography, mass spectrometry workflow
  • Pharmaceutical drug delivery & DMPK

研討會精彩回顧

在比較離子對試劑FA, TFA (如下圖) 所使用的C18本身是由di-isobutyl-octadecylsilane鍵結相構成立體空間保護的非封尾管柱

而在 ion pairing reagent 結合不同靜相比較時(如下圖),所使用的 C18 是有封尾的,因為其他靜相皆封尾,方能比較。

ion pairing reagent

管柱的封尾主要是要減少自由Si-OH的反應性以及保護silica support。然而,封尾的管柱也可能對氫鍵受體(如: 游離鹼基)的滯留較差,對質子化鹼基的滯留增加,因此仍需視您的分析物本身性質是否容易受到影響,這可由圖譜的結果觀察。

會後重點整理

  • 選用離子對試劑時,同時須考慮偵測器類型,如果同時要使用 UV 與 MS 偵測,DFA 是比 TFA 和 FA 更可使用的移動相添加劑替代品
  • DFA 提供比 FA 更好的分離效率,並且不會像 TFA 那樣對質譜分析引起強烈的離子抑制效應
  • 分析 peptides 或是 mAb 必須考慮溫度的影響,因為大分子 diffusion kinetics 較慢,需提高管柱溫度,避免其在管柱內停留太久,產生 artifact 或是recovery 差
  • 選擇不同管柱靜相時需同時考量所搭配的離子對試劑,如果我們選擇不同管柱化學搭配 「不影響 或 干擾」靜相選擇性的離子對試劑,可以得到很好的方法正交性,提升 sequence coverage %
  • DFA 雖然可提升efficiency 但同時也會遮蔽來自管柱所貢獻不同靜相的選擇性,而影響 resolution,因此,進行層析時 efficiency 與 resolution 需兩相權衡
  • 使用快速蛋白質分解酵素也可以減少 artifact